生物分離介質(zhì)分離純化中可去除內(nèi)毒素

　　內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，叫做脂多糖。脂多糖對(duì)宿主是有毒性的。內(nèi)毒素只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細(xì)胞后才釋放出來(lái)，所以叫做內(nèi)毒素。

　　其毒性成分主要為類脂質(zhì)A。內(nèi)毒素位于細(xì)胞壁的較外層、覆蓋于細(xì)胞壁的黏肽上。各種細(xì)菌的內(nèi)毒素的毒性作用較弱，大致相同，可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等。內(nèi)毒素可以用鱟試劑檢測(cè)。

　　內(nèi)毒素的去除

　　被污染的產(chǎn)品去除內(nèi)毒素即使在生產(chǎn)中采取了有效的工藝和嚴(yán)格的預(yù)防措施,原液仍有可能被污染,如何處理已被污染的原液是比較棘手的問題。因?yàn)樵褐型ǔＲ鸭尤氡Ｗo(hù)劑,重新純化是非常困難的。如果原液及保護(hù)劑的分子量與內(nèi)毒素分子量差別較大,那么選用適當(dāng)?shù)牡某瑸V膜,通過超濾來(lái)去除內(nèi)毒素是可能的,但由于膜吸附過程中產(chǎn)熱及系統(tǒng)殘留等原因,活性損失較大。

　　生物制品在生產(chǎn)過程中去除內(nèi)毒素也是純化環(huán)節(jié)中重要一環(huán)節(jié)。生物制品的純化,主要是采用各種柱層析技術(shù),如疏水層析、離子交換、親和層析、分子篩等,這些技術(shù)純化目標(biāo)產(chǎn)品的同時(shí)也可以有效去除內(nèi)毒素。

　　三、各類層析介質(zhì)去除內(nèi)毒素原理和情況

　　1.分子篩：分子篩是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)根據(jù)分子大小進(jìn)行分離的一種方法。一般重組產(chǎn)品分子量為幾萬(wàn)道爾頓,而內(nèi)毒素分子量為幾十萬(wàn)至上百萬(wàn)道爾頓,常是多聚體,因此利用分子篩可以有效去除內(nèi)毒素,但其處理量小,處理時(shí)間較長(zhǎng)。

　　2.疏水層析：內(nèi)毒素的脂肪A部份有很強(qiáng)的疏水性,但在高鹽下會(huì)凝集,無(wú)法掛上疏水層析柱?？蛇x擇能結(jié)合目標(biāo)蛋白的疏水介質(zhì)而去除內(nèi)毒素。

　　3.離子交換：離子交換法是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換而達(dá)到分離純化的方法。內(nèi)毒素在pH>2時(shí)帶負(fù)電荷,與陰離子交換介質(zhì)Q Bio-sep FF或DEAE Bio-sep FF有較強(qiáng)結(jié)合,可在洗脫目標(biāo)蛋白后用高鹽緩沖液或NaOH去除,這是離子交換法去除內(nèi)毒素的基礎(chǔ)。Pharmacia公司已開發(fā)利用離子交換層析法從白蛋白中去除內(nèi)毒素的工藝,主要采用DEAE Sepharose Fast Flow介質(zhì),將被內(nèi)毒素污染的白蛋白上柱,白蛋白和大部分內(nèi)毒素結(jié)合于介質(zhì)上,先清洗掉不結(jié)合的內(nèi)毒素,然后選擇性洗脫白蛋白。

　　4.親合層析：親合層析技術(shù),特別是免疫吸附劑在生產(chǎn)中的運(yùn)用使得生物大分子的純化變得簡(jiǎn)單。免疫吸附的原理基于抗原、抗體的特異性作用,以目標(biāo)蛋白作為抗原,將通過雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體偶聯(lián)于介質(zhì)上,以此介質(zhì)來(lái)吸附目標(biāo)蛋白。由于相互作用的高度特異性,理論上僅有目標(biāo)蛋白吸附于介質(zhì)上,內(nèi)毒素全部穿透,洗脫后將得到純度很高的無(wú)熱原產(chǎn)品。實(shí)際上,由于介質(zhì)本身存在的非特異性吸附,仍有少量的雜蛋白和內(nèi)毒素同時(shí)被吸附,但內(nèi)毒素含量是極低的。在干擾素(IFN)生產(chǎn)中,洗脫物內(nèi)毒素含量一般為0.25EUmL-1。

　　目前較為有效的處理方法是采用親和層析技術(shù)將毒素底物L(fēng)AL或多粘菌素B(PMB)偶聯(lián)于CNBr activated Bio-sep FF或NHS-activated Bio-sep FF上,以此介質(zhì)特異性吸附內(nèi)毒素,而讓蛋白通過。