干貨 | 如何精準(zhǔn)選擇色譜柱？

液相色譜柱種類繁多，在精準(zhǔn)選擇液相色譜柱之前，首先必須選擇HPLC的分離模式，根據(jù)使用的固定相和流動相的組合不同，可以得到下列各種各樣的分離模式。

色譜柱性能影響因素有很多，例如，硅膠純度、色譜柱尺寸、顆粒形狀、粒徑、表面積、孔徑，化學(xué)性質(zhì)包括鍵合類型、碳覆蓋率、封端，下面依次介紹各參數(shù)對色譜柱性能的影響，并根據(jù)以上參數(shù)精準(zhǔn)地選擇液相色譜柱。

1、硅膠純度

硅膠純度對強(qiáng)極性化合物的分離最為重要，殘留金屬離子濃度、硅膠的雜質(zhì)會影響化合物的峰形，硅膠表面的金屬含量高會影響堿性化合物的峰形，易發(fā)生拖尾。

2、色譜柱尺寸

增加色譜柱長度，可以在一定程度上提高柱效，但也會升高壓力和導(dǎo)致峰展寬；含量測定、溶出檢測等對于分離的要求較低，可選用較短的色譜柱，減少運(yùn)行時間。內(nèi)徑大，提高載樣量，但也會增加橫向擴(kuò)散，同樣會導(dǎo)致峰展寬。內(nèi)徑小的色譜柱靈敏度較高，峰型更窄，但是載樣量較小。如果載樣量滿足要求，需要更高更尖銳的峰提高靈敏度，可以選擇更小內(nèi)徑，但壓力較大，對系統(tǒng)要求較高。

短柱（15-100mm）運(yùn)行時間短、柱壓低；

長柱（150-250mm）分辨率高、運(yùn)行時間長；

小內(nèi)徑（≤2.1mm）檢測器靈敏度高；

大內(nèi)徑（3-21.2mm）載樣量高、耐污染、壽命長。

3、顆粒形狀

粒徑球形顆粒柱效高、重現(xiàn)性好、柱床結(jié)構(gòu)均勻，不規(guī)則形柱床結(jié)構(gòu)不均勻、流動相線速度不均勻，容易譜帶展寬；當(dāng)使用粘度較大流動相時，球形顆粒可降低柱壓，延長色譜柱壽命。

常見的兩種填料顆粒類型：

相同鍵合基團(tuán)鍵合技術(shù)選擇性相同；全多孔填料更為常見，鍵合相種類更多；核殼型填料可以在較大的粒徑下得到更高柱效，從而降低使用壓力。

4、粒徑

粒徑指柱填料顆粒直徑的大小，實際上色譜柱上所標(biāo)的粒徑是一個平均值，通常1.5-10μm。粒徑小的色譜柱分離度較好，但色譜柱壓力更大，如果5μm粒徑的色譜柱分離度稍有不足，則同型號3μm色譜柱的分離度一般會提供令人滿意的選擇性。

5、表面積

表面積是指顆粒外表面與內(nèi)部孔面積的總和，以m²/g表示，高表面積對于多組分樣品的分離具有較強(qiáng)的保留能力、柱容量和分離度；表面積低的柱填料能迅速達(dá)到平衡狀態(tài)，對于梯度洗脫尤為重要。

6、孔徑

孔徑是指填料顆粒的孔或腔的平均尺寸，范圍是120～300?，多孔色譜填料與目標(biāo)物的作用絕大部分（＞95%）是發(fā)生在填料顆粒的內(nèi)部，即孔內(nèi)的，所以孔對于色譜填料也是最重要的參數(shù)之一，一款填料孔徑大小(Pore Size)和孔徑分布(Pore Size Distribution)，在絕大多數(shù)的色譜分離純化中，起到關(guān)鍵性作用。

大孔徑的填料顆?？梢匝娱L大分子溶質(zhì)在填料表面的滯留時間，達(dá)到充分分離，改善峰形，所以大孔徑填料適合分離大分子化合物或者水動力體積較大的分子；較小孔徑提供較高的表面積，可用于較大的載荷量，并保留小的有機(jī)化合物，可用于小分子有機(jī)物到聚合物的分離。

孔徑和粒徑的關(guān)系：

樣品分子直徑小于平均孔徑才能進(jìn)入微粒內(nèi)部，所選色譜柱孔徑至少是樣品流體學(xué)直徑的4倍，一般根據(jù)樣品的分子量選擇適合的孔徑。

分子量＜2000， 選擇孔徑80～180?

分子量＞2000，選擇孔徑300?，300?全多孔色譜柱可用于分離蛋白質(zhì)和多肽。

7、不同的載碳量

載碳量越高，固定相傳質(zhì)效應(yīng)增加，高載碳量，有利于不易保留化合物的分離，水解穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性好；低載碳量，有利于分析有一定保留的化合物，降低溶劑損耗、減少運(yùn)行時間。

8、封端

硅膠鍵合相填料中有部分未封端的殘留硅羥基，封端可以減輕待測組分與硅膠表面殘留的酸性硅羥基反應(yīng)，改善保留和峰形，這對于堿性化合物尤其重要。而不同的封端技術(shù)也會直接影響色譜柱的效能。